古DNA技術如何“浪里淘金” _DNA

古DNA技術如何“浪里淘金”
（）據中國科學報（采訪人員胡珉琦實習生滕文鈺）：重建已滅絕古人類——尼安德特人和丹尼索瓦人的全基因組、繪制全球人群遷徙交流歷史、挖掘最古老東亞現代人“田園人”的遺傳結構、揭示東亞人群末次盛冰期前后適應性基因的變化、追溯中國南北方人群格局的形成、溯源南島語系人群的中國南方起源……在過去十余年里，研究人員利用古DNA技術發掘出那些遺落了成千上萬年的遺傳信息，從中抽絲剝繭，不斷刷新人類對自身演化歷程的認知。
7月21日，《細胞》發布特刊討論了最新生物技術的前沿發展。中國科學院古脊椎動物與古人類研究所研究員付巧妹團隊受邀領銜古DNA前沿領域針對古DNA技術發展與未來發表評述性論文。文章回顧了古DNA技術的發展歷史和突破，探討了目前的技術瓶頸和解決方案，以及未來古DNA技術的發展方向與前景。
高通量測序將古DNA領域“一網打盡”
高通量測序，又叫二代測序，是一種快速測定大量DNA序列的技術。在高通量測序普及之前，古DNA領域只能依賴PCR技術測定少數特定DNA片段的序列。
“這種方法獲取的DNA信息極其有限，而且難以區分真正的古DNA和污染DNA 。高通量測序理論上能測序樣本中所有DNA分子的信息，且成本逐年降低。即使是含量極低的古DNA，也能很有效地對其進行測序 ?！备肚擅媒忉尩?。不僅如此，通過生物信息學手段，還能快速檢測樣本中是否存在古DNA損傷，從而達到鑒別古DNA的目的。這一方法也成了領域中古DNA檢測的重要標準。
除此之外，研究人員還根據古DNA的特點，對高通量測序的實驗方法（DNA文庫構建）進行了多種調整與優化。
付巧妹提到，half-UDG處理和單鏈DNA文庫的構建是最重要的兩項技術突破。Half-UDG技術既能保留部分DNA末端損傷，又能修復大部分古DNA損傷，從而在保留古DNA特征的同時，提高古DNA測序結果的準確性。而單鏈DNA文庫則針對古DNA中常常存在大量單鏈黏性末端的情況，直接將雙鏈DNA變性成單鏈DNA構建文庫，從而更有效地對受損的單鏈古DNA測序。
DNA捕獲技術挑戰極限
“盡管高通量測序已能較為有效地測序古DNA，但由于古DNA提取物中常常包含大量污染DNA，使得測序的大部分DNA分子都是沒有用的信息，真正有用的古DNA序列常常只占測序數據的1%不到。”付巧妹表示。
對此，研究人員在古DNA領域研發應用了DNA捕獲技術——通過設計DNA或RNA探針，像釣魚一樣把目標古DNA從海量的污染DNA中“釣取”出來。
這項技術目前已廣泛應用于人類古基因組研究中，有超過2/3的人類古基因組數據來自于一個名為“1240k”的探針組捕獲的數據。
“DNA捕獲技術不僅使得古DNA測序效率大大提高，還能有效地從一些‘棘手’的樣本中得到足夠的數據用于分析。”付巧妹說。
一個典型的例子就是付巧妹團隊去年發表在《細胞》上的古代南方人群的基因組研究。中國南方溫暖、潮濕的環境和當地的酸性土壤十分不利于古DNA的保存，使得這片區域的古DNA研究一度處于空白狀態。當時，正是利用DNA捕獲技術，付巧妹團隊成功獲取了30個古南方人群的基因組信息，揭示了1萬余年以來東亞和東南亞交匯處的人群遺傳史。
最近，古DNA研究人員進一步挑戰極限，擺脫化石的桎梏，直接從“土”里提取古DNA 。這項技術已成功應用于丹尼索瓦洞和白石崖溶洞，成功獲取了數萬年前的已滅絕古人類的DNA 。古DNA技術不斷迭代、“浪里淘金”的過程仍在持續。
未來要攻克的難關
雖然古DNA領域成果豐碩，但古DNA研究卻一直充滿了艱辛和挑戰。
古DNA本身極易受到污染，實驗要求極為精細，而以往古DNA提取和建庫幾乎全程依賴人工操作。付巧妹介紹，最近，在全球少數幾個實驗室中，部分古DNA實驗步驟已經成功整合到了全自動移液機器人平臺中，不僅極大節省了人力和物力，還減少了人工操作引入污染的風險。
“目前樣品的前處理步驟仍只能依賴人工，如何把這項耗時、耗力的工作整合到自動化體系中，是古DNA實驗技術需要攻克的下一道難關 ?！备肚擅弥赋?。
此外，古DNA技術的應用遠不止于人類古基因組。付巧妹介紹，通過古微生物DNA信息追溯古代疫病流行和共生微生物演化，利用古表觀遺傳學信息探究古代動物和環境的相互作用，以及利用古蛋白質探索更大時間尺度的人類演化，這些都是古分子的重要分支方向。在她看來，如何更有效地獲取這些信息，并把信息進行多維度結合，是未來研究的難點之一。
古DNA是帶著時間刻度的遺傳信息，它從獨特的視角書寫了人類數萬年來的演化與適應。這些歲月的痕跡不僅記錄了人類的遺傳歷史，還在持續地影響著現今人群的生理和健康。
“我們推測，一些重要功能基因單倍型就來自于已滅絕古人類，這些基因涉及到先天免疫、脂代謝、高海拔適應性、膚色、新冠重癥易感性等。此外，還有我們東亞人群特有的與頭發和牙齒表型相關的基因型，也是在末次盛冰期之后頻率升高，推測與環境適應性相關 ?！备肚擅帽硎?。
此外，還有很多古DNA研究發現的特殊基因型的功能尚未確定。付巧妹認為，未來，可以通過構建動物模型并結合基因編輯技術對這些發現進行驗證 ?！敖Y合古DNA技術與現代前沿分子生物學技術，我們可以更清晰地理解演化史對當今人類健康的影響。”
相關論文信息：https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.06.009
《中國科學報》 (2022-07-22 第1版要聞)
相關報道：浪里淘金——付巧妹團隊《細胞》撰文細數古DNA技術發展史
（）據中國科學院古脊椎動物與古人類研究所：基因組三維結構、類器官技術、微生物組學研究、大腦單細胞測序、癌癥疫苗……突飛猛進的生物技術不僅推動了科學研究的發展，也滲入我們生活的方方面面，影響著當今人類的生活與健康。對此，《細胞》雜志發布特刊，專題討論最新生物技術的前沿和發展。中國科學院古脊椎動物與古人類研究所（以下簡稱“中科院古脊椎所”）付巧妹研究員受邀針對古DNA技術的發展與未來撰寫評述性論文（第一作者為中科院古脊椎所特別研究助理劉逸宸）。該論文 “Evolving ancient DNA techniques and the future of human history” 于2022年7月21日在《細胞》雜志上在線發表。
重建已滅絕古人類——尼安德特人和丹尼索瓦人——的全基因組、繪制全球人群遷徙交流歷史、挖掘最古老東亞現代人“田園人”的遺傳結構、揭示東亞人群末次盛冰期前后適應性基因的變化、追溯中國南北方人群格局的形成、溯源南島語系人群的中國南方起源……在過去十余年里，研究人員利用古DNA技術發掘出那些遺落了成千上萬年的遺傳信息，從中抽絲剝繭，不斷刷新我們對人類歷史的認知。
受《細胞》雜志邀請，付巧妹及團隊撰文回顧了古DNA技術的發展歷史和突破，探討了目前的技術瓶頸和解決方案，展望了未來古DNA技術的發展方向與前景。
一網打盡——高通量測序革新古DNA領域
高通量測序，又叫“二代測序” ，是一種快速測定大量DNA序列的技術。在高通量測序普及之前，古DNA領域只能依賴PCR技術測定少數特定DNA片段的序列。這種方法獲取的DNA信息極其有限，而且難以區分真正的古DNA和污染DNA 。高通量測序理論上能測序樣本中所有DNA分子的信息，且成本逐年降低。即使是含量極低的古DNA，也能很有效地對其進行測序。不僅如此，通過生物信息學手段（如mapDamage軟件），我們還能快速檢測樣本中是否存在古DNA損傷，從而達到鑒別古DNA的目的。這一方法，也成了領域中古DNA檢測的重要標準。
除此之外，研究人員還根據古DNA的特點，對高通量測序的實驗方法（DNA文庫構建）進行了多種調整與優化。其中，half-UDG處理和單鏈DNA文庫的構建是最重要的兩項技術突破。Half-UDG技術既能保留部分DNA末端損傷，又能修復大部分古DNA損傷，從而在保留古DNA特征的同時，提高古DNA測序結果的準確性。單鏈DNA文庫則是針對古DNA中常常存在大量單鏈粘性末端的情況，直接將雙鏈DNA變性成單鏈DNA構建文庫，從而更有效地測序受損的單鏈古DNA 。
挑戰極限——DNA捕獲技術的應用和發展
盡管高通量測序已能較為有效地測序古DNA，但由于古DNA提取物中常常包含大量污染DNA，使得測序的大部分DNA分子都是無用的信息，真正有用的古DNA序列常常只占測序數據的1%不到。對此，研究人員在古DNA領域研發應用了DNA捕獲技術——通過設計DNA或RNA探針，像釣魚一樣把目標古DNA從海量的污染DNA中“釣取”出來。這項技術廣泛應用于人類古基因組研究中，目前超過2/3的人類古基因組數據來自于一個叫“1240k”的探針組的捕獲數據。
DNA捕獲技術不僅使得對古DNA的測序效率大大提高，還能有效從一些“棘手”的樣本中得到足夠的數據用以分析。一個典型的例子是去年發表在《細胞》雜志上的古代南方人群的基因組研究。中國南方溫暖潮濕的環境和當地的酸性土壤都不利于古DNA的保存，使得這片區域的古DNA研究一度處于空白狀態。利用DNA捕獲技術，付巧妹團隊成功獲取了30個古南方人群的基因組信息，揭示了一萬余年以來東亞和東南亞交匯處的人群遺傳史。
最近，古DNA研究人員進一步挑戰極限，他們脫離化石的桎梏，直接從“土”（沉積物）里提取古DNA 。這項技術已成功應用在丹尼索瓦洞和白石崖溶洞中，成功獲取了數萬年前的古老型人類的DNA 。
未來可期——提升效率、拓展視野、著眼當今人類健康
雖然古DNA領域成果豐碩，但古DNA研究卻一直充滿了艱辛和挑戰。古DNA本身極易受到污染，其實驗也極為精細，以往古DNA提取和建庫幾乎全程都依賴人工操作。最近，在全球少數幾個實驗室中，部分古DNA實驗步驟成功整合到全自動移液機器人平臺中，不僅極大節省了人力和物力，還減少了人工操作引入污染的風險。然而，目前樣品的前處理步驟仍只能依賴人工，如何把這項耗時耗力的工作整合到自動化體系中，是古DNA實驗技術的需要攻克的下一道難關。
另外，古DNA技術的應用遠不止于人類古基因組。通過古微生物信息追溯古代疫病流行和共生微生物演化、利用古表觀遺傳學信息探究古代動物和環境的相互作用、以及利用古蛋白質探索更大時間尺度的人類演化，都是古分子的重要分支方向。如何更有效地獲取這些信息，并將信息進行多維度結合，將是未來研究的難點之一。
古DNA是帶著時間刻度的遺傳信息，它從獨一無二的視角書寫了人類數萬年來的演化與適應。這些歲月的痕跡不僅記錄了人類的遺傳歷史，還在持續地影響著現今人群的生理和健康。我們一些重要功能基因單倍型就推測來自于已滅絕古人類，這些基因涉及到先天免疫、脂代謝、高海拔適應性、膚色、新冠重癥易感性等。還有我們東亞人群特有的與頭發和牙齒表型相關的基因型，也是在末次盛冰期之后頻率升高，推測與環境適應性相關。然而，還有很多很多古DNA研究發現的特殊基因型的功能還未能確定。在未來，可以通過構建動物模型并結合基因編輯技術對這些發現進行驗證。結合古DNA技術與現代前沿分子生物學技術，我們將能更清晰地理解演化史對我們當今人類健康的影響。
本論文由中科院古脊椎所劉逸宸特別研究助理，E. Andrew Bennett副研究員，付巧妹研究員共同完成。通訊作者為付巧妹研究員。本研究由中國科學院、國家自然科學基金委、騰訊科學探索獎及美國霍華德·休斯醫學研究所資助。(Information of the authors and fundings)